寬場顯微成像通常是活細(xì)胞成像的首選，因?yàn)樗軌蚋?、更溫和地成像?/span>最先進(jìn)的寬場顯微成像使用 LED 光源和濾光片組。盡管有很多濾光片都可以用于各種不同的熒光團(tuán)組合，但是為了獲得用多個熒光團(tuán)標(biāo)記的樣本的正確圖像，需要考慮多個因素。

大多數(shù)用于活細(xì)胞成像的熒光團(tuán)都具有寬發(fā)射光譜。這一事實(shí)通常意味著各個探測通道之間會出現(xiàn)串?dāng)_現(xiàn)象，例如，您會在紅色探測通道中看到來自綠色通道的一些發(fā)射光。在活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中使用多個標(biāo)記時(shí)，熒光光譜重疊現(xiàn)象很常見，因此為了確?？吹较胱R別的細(xì)節(jié)，可以使用窄帶濾光片。但是，這種方法會導(dǎo)致靈敏度下降并影響結(jié)果，因?yàn)榛罴?xì)胞中的熒光團(tuán)信號水平通常較低，尤其是對于靶標(biāo)豐度稀疏的樣本或以內(nèi)源性水平表達(dá)的樣本。使用更多激發(fā)光來抵消靈敏度下降通常不可行，因?yàn)檫@種方法對樣本的危害性會增加（即光毒性增加）。

在活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，高速采集通常至關(guān)重要，特別是在研究快速動態(tài)過程時(shí)，如囊泡觀察。使用濾光片會導(dǎo)致速度受限，因?yàn)樵诟淖兠糠N顏色的濾光片組時(shí)必須依次成像。按順序采集圖像比同時(shí)采集圖像需要更多時(shí)間，因此在采集過程中可能會錯過樣本的快速運(yùn)動，因?yàn)閺囊粋€圖像到下一個圖像時(shí)每種顏色都有更長的時(shí)間間隔。此外，當(dāng)兩種或多種顏色之間的直接比較至關(guān)重要時(shí)，例如在上述囊泡觀察實(shí)驗(yàn)中：信號甚至可能在兩次熒光團(tuán)采集之間已經(jīng)移動，從而加大數(shù)據(jù)解釋的難度。

研究活細(xì)胞中多個探針之間的相互作用而獲得的大量信息可提供生理學(xué)方面更重要的結(jié)果，因此人們開發(fā)了多種方法來拆分復(fù)雜的混合發(fā)射光信號。

為了能夠使用多個標(biāo)簽，以便從一個樣本中獲得更深入的認(rèn)識，您可以使用光譜圖像信息線性拆分方法，它可以分析每個熒光團(tuán)對總信號的貢獻(xiàn)。要進(jìn)行線性光譜拆分，必須為所有可能的參考光譜混合方式計(jì)算未知光譜與參考光譜之間的最小差值 ⁽¹⁾。這種方法通常用于對多種顏色成像，即使它們重疊。但是在寬場顯微成像中，您仍可能遺漏關(guān)鍵信息，因?yàn)楸仨殞颖局忻總€熒光團(tuán)依次成像，這會導(dǎo)致速度受限。

有一種方法可以快速拆分多種顏色，而不必?fù)?dān)心采集期間光譜重疊，也無需學(xué)習(xí)復(fù)雜的光譜拆分方法。

最近發(fā)表的一些文章介紹了一種基于相量的光譜拆分方法 ^{(2, 3)}。光譜相量分析可將每個像素的光譜成分轉(zhuǎn)換為二維圖中的一個位置。這樣就可以利用簡單的數(shù)學(xué)方法即時(shí)、可靠地分離不同染料的發(fā)射光。此外，它還可以僅基于光譜而不是強(qiáng)度來增加濾光——從而保留圖像的細(xì)微細(xì)節(jié)，同時(shí)減少可能會影響線性光譜拆分的噪聲。由于實(shí)際上消除了串?dāng)_以及自發(fā)熒光等干擾因素，選擇合適的熒光探針組合不再是問題，因此以這種方式成像可以更輕松地設(shè)置多通道活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。